Konvergente Synthese von Phosphordiamidat-Morpholino-Oligonukleotiden (PMOs) durch H

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12576 (2023) Diesen Artikel zitieren

Details zu den Metriken

Phosphordiamidat-Morpholino-Oligonukleotide (PMOs) sind eine vielversprechende Art von Antisense-Oligonukleotiden, ihre schwierige Synthese macht sie jedoch schwer zugänglich. Diese Forschung präsentiert einen effizienten Syntheseansatz für PMOs unter Verwendung des H-Phosphonat-Ansatzes. Die Verwendung von Kondensationsreagenzien vom Phosphoniumtyp verkürzte die Kopplungszeiten im Vergleich zum aktuellen Syntheseansatz erheblich. Darüber hinaus erleichterten Kondensationsreagenzien vom Phosphoniumtyp die Fragmentkondensation von PMO und synthetisierten bis zu 8-mere, die alle vier Nukleobasen enthielten, mit bemerkenswerter Kopplungseffizienz. Dies ist der erste Bericht über die konvergente Synthese von PMOs. Dieser Ansatz würde die groß angelegte Synthese von PMOs erleichtern und ihre Popularität und Zugänglichkeit als Therapie der nächsten Generation beschleunigen.

Der Antisense-Ansatz hat bei Forschern als potenzielle zukünftige Therapie zur Kontrolle der Expression krankheitsbezogener Gene Aufmerksamkeit erregt1,2,3. Phosphordiamidat-Morpholino-Oligonukleotide (PMOs) mit nichtionischen internukleotiden Bindungen und einem Morpholino-Rückgrat gelten als vielversprechende Antisense-Medikamente4,5. Die hohe Bindungsaffinität zur Ziel-mRNA4, die Sequenzspezifität6,7, die Löslichkeit in Wasser6 und die geringe Toxizität von PMO7,8,9,10 wurden in früheren Studien bestätigt. Bisher wurden vier Antisense-Medikamente gegen Duchenne-Muskeldystrophie zugelassen (Exondys 51®11, Vyondys 53®12, Viltepso®13, Amondys 45®14) und es wird erwartet, dass in Zukunft weitere PMO-Medikamente zugelassen werden. Darüber hinaus wurde ein neues PMO-Analogon namens Thiophosphoramidat-Morpholino-Oligonukleotide (TMOs) synthetisiert, das Potenzial als neuer Arzneimittelkandidat in der Antisense-Therapie zeigte15. Schnelle Fortschritte bei PMOs haben den Bedarf an der Entwicklung effizienter Ansätze für die Synthese von PMOs und PMO-Analoga erhöht. Insbesondere der synthetische Ansatz, der PMOs in großem Maßstab auf einmal synthetisieren kann, ist für die Verfügbarkeit einer Antisense-Therapie für Patienten erforderlich. Bis heute wurden viele Syntheseansätze entwickelt. Der erste Syntheseansatz für PMOs wurde von Summerton und Weller5 beschrieben (Abb. 1-A). Bei diesem Ansatz wurden Morpholinonukleoside mit einer N,N-Dimethylaminochlorphosphoramidat-Einheit an der 5′-Hydroxygruppe und einer Tritylgruppe (Tr) an der Aminogruppe als Monomereinheiten (A) eingesetzt. PMOs wurden durch wiederholte Kondensation der 5′-N,N-Dimethylaminochlorphosphoramidatgruppe des Monomers (A) mit der Aminogruppe am 3′-Ende des Oligomers nach Entfernung der Tr-Gruppe am 3′-Ende5 synthetisiert. Dieser Ansatz ist weit verbreitet, weist jedoch mehrere bekannte Probleme auf, darunter eine geringe Reaktivität der Monomere und lange Reaktionszeiten bis zur Vervollständigung der Kondensationsreaktion. Im Jahr 2012 haben Harakawa et al. entdeckten, dass die Zugabe von LiBr zu einer Reaktionsmischung wirksam war und zu einer erheblichen Beschleunigung der Reaktion führte (ca. zehnfache Verbesserung)16. Darüber hinaus fanden Li et al.17 heraus, dass durch Erhöhen der Reaktionstemperatur auf 90 °C die Kondensationsreaktion innerhalb von 8 Minuten abgeschlossen war, sodass sie mithilfe eines Durchflussreaktors in nur 3,5 Stunden ein 18mer-PMO synthetisieren konnten. Kundu et al.18 berichteten über die Synthese von PMO mithilfe eines automatisierten Oligo-Synthesizers. In diesem Bericht wurde eine Lösungsphasensynthese von 3-mer PMO mithilfe der Fmoc-Chemie erreicht. Darüber hinaus wurden 30-mer-PMOs mit einem DNA-Synthesizer synthetisiert.

Aktuelle Ansätze zur Synthese von PMO-Derivaten.

Kürzlich berichteten Langner et al.15 über einen neuartigen Syntheseansatz zur Synthese von TMOs unter Verwendung von Phosphordiamidit-Derivaten als Monomeren (Abb. 1-B). Im Gegensatz zu PMO verfügen TMOs über eine Phosphorothioamidat-Bindung, die als Antisense-Oligonukleotide vielversprechende Eigenschaften zeigten. TMOs zeigten eine hohe RNA-Bindungsaffinität und eine hohe Nukleasestabilität. Darüber hinaus zeigten chimäre TMOs ihr Potenzial als microRNA-Inhibitoren. Wie in Abb. 1-B gezeigt, verwendet dieser Ansatz Morpholinophosphordiamidit-Derivate, die eine 4,4′-Dimethoxytrithylgruppe (DMTr) an der 5′-Hydroxygruppe (B) als Monomereinheiten tragen. Der Syntheseprozess umfasste die Kondensation eines Morpholinophosphordiamidit-Monomers (B) mit der Hydroxygruppe am 5ʹ-Ende des Oligomers in Gegenwart eines sauren Aktivators wie 5-Ethylthio-1H-tetrazol (ETT) und anschließende Schwefelung ein Phosphoramidit-Zwischenprodukt (C). Die anschließende Detritylierung gefolgt von sich wiederholenden Synthesezyklen erzeugte TMOs. Die angegebene Kopplungsausbeute betrug 95–97 % bei einer Kondensationsreaktionszeit von 5 Minuten15. Obwohl dieser Ansatz für die Synthese von TMOs effektiv ist, ist er nicht auf die Synthese von PMOs anwendbar. Diese Methode ergab das Phosphoramidit-Derivat (C) als Zwischenprodukt, aber aus diesem Zwischenprodukt wird die gewünschte Phosphordiamidat-Verknüpfung von PMO nicht erhalten.

Im Jahr 2015 entwickelten Bhadra et al.19 einen neuen Ansatz zur Synthese von Polythymidin-PMOs mithilfe der H-Phosphonat-Chemie (Abb. 1-C). Bei diesem Ansatz wurden 5ʹ-H-Phosphonatmonoester-Morpholinonucleoside (D) als Monomereinheiten eingesetzt. Die 5ʹ-H-Phosphonat-Monomere (D) wurden unter Verwendung eines Phenolderivats und Pivaloylchlorid als Kondensationsreagenz in Aryl-H-Phosphonat-Zwischenprodukte (E) umgewandelt. Anschließend wurden Aryl-H-phosphonat-Zwischenprodukte (E) mit der Aminogruppe am 3ʹ-Ende eines Oligomers kondensiert. Die anschließende Detritylierung gefolgt von sich wiederholenden Synthesezyklen führte zu Morpholino-Oligomeren mit internukleotiden H-Phosphonamidat-Bindungen. Schließlich wurden internukleotidische H-Phosphonamidat-Verknüpfungen durch Behandlung mit Jod und Dimethylamin in Phosphordiamidat-Gegenstücke umgewandelt, um PMOs zu erzeugen. Dieser Ansatz erzielte eine hohe Kopplungsausbeute (98–100 %) bei einer kurzen Kondensationsreaktionszeit (10 min)19. Dieser Ansatz erforderte jedoch die Voraktivierung von H-Phosphonatmonomeren (D), was die Verfahren komplexer machte.

Frühere Studien haben die Synthese von H-Phosphonamidat20,21,22,23 eingehend untersucht. Diese Studien zeigten, dass ein spezifisches Amin unter Verwendung eines spezifischen Kondensationsreagenzes direkt mit einem H-Phosphonatmonoester kondensiert werden konnte20,21,22,23. Basierend auf diesen Erkenntnissen haben wir kürzlich ein H-Phosphonamidat mit einer Morpholinogruppe synthetisiert, indem wir einen H-Phosphonatmonoester direkt mit Morpholin unter Verwendung von BOPCl als Kondensationsreagenz kondensierten24. Daher haben wir versucht, das H-Phosphonat-Monomer des Morpholino-Nukleosids direkt mit der Aminogruppe des 3ʹ-Morpholin-Nukleosids zu kondensieren, indem wir ein spezifisches Kondensationsreagenz verwendeten (Abb. 1-D).

Bei den meisten PMO-Synthesen wird üblicherweise eine lineare Synthesemethode verwendet, bei der eine Monomereinheit mit einem verlängernden Oligomer gekoppelt wird (Abb. 1-E)5,17,19. Diese Methode führt zur Bildung von N-1-mer, das eine Base kürzer als das Produkt ist. Die Trennung des N-1-mers ist aufgrund der ähnlichen Lipophilie zwischen dem gewünschten Produkt und dem N-1-mer tendenziell schwierig. Um dieses Problem zu lösen, ist die Fragmentkondensation wirksam, da sie die Bildung von N-1-meren durch die Kondensation zweier Oligomere vermeidet. Daher würde die Trennung des Produkts von den nicht umgesetzten Fragmenten vereinfacht, da zwischen ihnen ein erheblicher Unterschied in der Lipophilie besteht. Darüber hinaus reduziert der Fragmentkondensationsansatz die Reaktionsschritte, die für die Synthese von Oligomeren erforderlich sind. Bei der Oligodesoxynukleotidsynthese wurde der Nutzen der konvergenten Synthesemethode für die Herstellung demonstriert25. Aufgrund der geringen Effizienz der internukleotiden Bindungsbildungsreaktion des bestehenden Ansatzes wurde die Fragmentkondensation von PMOs jedoch noch nicht untersucht.

In dieser Forschung haben wir einen effizienten Syntheseansatz für PMOs entwickelt, bei dem H-Phosphonatmonoester-Derivate als Monomereinheiten verwendet werden. Die Kondensationsreagenzien vom Phosphoniumtyp ermöglichten die direkte Bildung einer H-Phosphonamidat-Bindung, und dieser Ansatz ermöglichte die Fragmentkondensation.

Zunächst wurden 5ʹ-O-tert-Butyldiphenylsilyl (TBDPS)-morpholino-Nukleoside 1 und H-Phosphonat-Monomere 2 aus 5ʹ-Hydroxy-N-trityl (Tr)-morpholino-Nukleosiden von N4-Benzoylcytidin (mCbz), N6-Benzoyladenosin ( mAbz), N2-Isobutyryl-O6-cyanoethylguanosin (mGi-bu,CE) und Thymidin (mT) (siehe SI). Als nächstes wurde ein Dimorpholinocytidin-H-Phosphonamidat-Derivat 3cc unter Verwendung des erhaltenen H-Phosphonat-Monomers 2c und des Morpholino-Nukleosids 1c synthetisiert. Die 1,2 Äquivalente des H-Phosphonatmonomers 2c wurden mit der Aminogruppe von 1c unter Verwendung von 3,0 Äquivalenten verschiedener Kondensationsreagenzien in CD3CN-Pyridin (1:1, Vol./Vol.) bei 0 °C für 20 Minuten kondensiert (Tabelle 1). Die Umwandlungsrate wurde durch 31P-Kernresonanzanalyse (NMR) der Reaktionsmischung bei Raumtemperatur bestimmt. Die Kondensationsreaktion mit Pivaloylchlorid (PivCl), die üblicherweise für die Kondensationsreaktion der DNA-Synthese nach dem H-Phosphonat-Ansatz eingesetzt wird, führte nicht zum gewünschten Produkt (Eintrag 1). Wir stellten die Hypothese auf, dass die Aminogruppe des Morpholinonukleosids 1c mit PivCl und/oder einem Acyl-H-phosphonat-Zwischenprodukt reagiert und als Amidderivat verkappt wurde. Sobkowska et al.20 hatten zuvor eine ähnliche Nebenreaktion bei der Synthese von H-Phosphonamidat-Derivaten unter Verwendung von PivCl als Kondensationsreagenz bestätigt. Daher stimmte das Ergebnis von Eintrag 1 mit dem vorherigen Bericht überein. Allerdings unter Verwendung von Kondensationsreagenzien wie Bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)phosphinsäurechlorid (BOPCl) (Eintrag 2), Benzotriazol-1-yloxy-tris(pyrrolidin-1-yl)phosphoniumhexafluorphosphat (PyBOP) (Eintrag 3) , 2-(Benzotriazol-1-yloxy)-1,3-dimethyl-2-pyrrolidin-1-yl-1,3,2-diazaphospholidiniumhexafluorphosphat (BOMP)26 (Eintrag 4), 3-Nitro1,2,4- Triazol-1-yl-tris(pyrrolidin-1-yl) phosphoniumhexafluorphosphat (PyNTP)27 (Eintrag 5) und 1,3-Dimethyl-2-(3-nitro-1,2,4-triazol-1-yl )-2-pyrrolidin-1-yl-1,3,2-diazaphospholidiniumhexafluorphosphat (MNTP)27 (Eintrag 6) lieferte das H-Phosphonamidat-2-mer 3cc als Primärprodukt. Die Bildung von 3cc wurde mittels 31P-NMR (δ 13,3, 14,2 ppm, 1JPH = 661,1, 654,6 Hz) verifiziert. Insbesondere BOPCl, BOMP und PyNTP ergaben 3 cm³ mit über 98 % NMR-Ausbeute. BOMP, PyNTP und MNTP sind Kondensationsreagenzien, die wir in einer früheren Studie für die Kondensationsreaktionen des H-Phosphonat-Ansatzes entworfen und synthetisiert haben26,27. Diese Kondensationsreagenzien weisen als Kondensationsreagenzien eine hohe Reaktivität auf, wohingegen sie gegenüber der Aminogruppe weniger reaktiv sind26,27. Wir gingen davon aus, dass Kondensationsreagenzien vom Phosphoniumtyp aufgrund dieser Vorteile bessere Ergebnisse bei der Bildung von H-Phosphonamidat-Bindungen lieferten. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass die Reaktivitätsreihenfolge von Kondensationsreagenzien MNTP > PyNTP > PyBOP ist. Dies könnte auf die Fähigkeit von Abgangsgruppen (HOBt oder 3-Nitro-1,2,4-triazol (NT)) und die Struktur des Phosphoniumzentrums zurückzuführen sein26,27. Bei dieser Methode zeigte PyNTP jedoch ein besseres Ergebnis für die Kondensationsreaktion. Die geringere NMR-Ausbeute bei Verwendung von MNTP war auf die Bildung von Nebenprodukten zurückzuführen. Aufgrund der höheren Aktivität als Kondensationsreagenz könnte die Aktivierung von 2c durch MNTP zu einer Überaktivierung und einer geringeren Kondensationseffizienz geführt haben. Daher wurden BOPCl, BOMP und PyNTP als Kondensationsreagenzien für weitere Untersuchungen ausgewählt.

Zusammenfassend ist uns die direkte Kondensation des H-Phosphonatmonoesters und der Aminogruppe des Morpholino-Nukleosids gelungen. Darüber hinaus war die Kondensationsreaktion innerhalb von 20 Minuten abgeschlossen.

Obwohl wir versuchten, das H-Phosphonamidat 2-mer 3cc zu isolieren, war 3cc instabil und hydrolysierte während der Extraktion und Reinigung durch Kieselgel-Säulenchromatographie leicht. Daher haben wir versucht, die erhaltene H-Phosphonamidat-Bindung in einer Eintopfreaktion nach der Kondensationsreaktion in eine stabile Phosphordiamidat-Bindung umzuwandeln.

Als nächstes optimierten wir die Reaktionsbedingungen einer Kondensationsreaktion und einer oxidativen Aminierung als Eintopfreaktion (Tabelle 2). Um eine H-Phosphonamidat-Verknüpfung zu bilden, wurden die 1,2 Äquivalente des H-Phosphonat-Monomers 2 mit 1, das die Aminogruppe trägt, unter Verwendung von BOPCl oder PyNTP kondensiert. Dann wurde bei 0 °C das H-Phosphonamidat-Derivat 3 durch Zugabe einer Mischung aus Dimethylamin und einem Halogenierungsreagenz (I2, CBr4 oder CCl4) zur Reaktionsmischung in ein Phosphordiamidat-Derivat 4 umgewandelt. Die Umwandlungsrate wurde mithilfe einer 31P-NMR-Analyse der Reaktionsmischung bestimmt. Zunächst untersuchten wir den Einfluss der Halogenierungsreagenzien auf die Reaktionsergebnisse und stellten fest, dass CCl4 die besten Ergebnisse lieferte (siehe SI). Die Bildung von 4cc wurde mittels 31P-NMR (δ 16,5, 16,9 ppm) bestätigt. Allerdings war die NMR-Ausbeute des gewünschten Produkts mäßig (47 %), wenn BOPCl als Kondensationsreagenz verwendet wurde (Tabelle 2, Eintrag 1). Anschließend wurde PyNTP als Kondensationsreagenz anstelle von BOPCl eingesetzt, was das Ergebnis deutlich verbesserte (91 %, Eintrag 2). Wir gingen davon aus, dass die Rückstände des Kondensationsreagens die oxidative Aminierungsreaktion beeinflussten (siehe SI). Das Äquivalent an Dimethylamin wurde in Eintrag 3 auf 38 Äquivalente erhöht, was die NMR-Ausbeute auf 98 % verbesserte. Es wird angenommen, dass die oxidative Aminierungsreaktion von H-Phosphonamidat aus einer Tautomerisierung zum dreifach koordinierten Phosporamidit-Zwischenprodukt, einer oxidativen Halogenierungsreaktion mit CCl4 und einer anschließenden Aminierung des resultierenden Zwischenprodukts besteht28,29,30. Überschüssige Mengen an Dimethylamin fungierten als Base und beschleunigten die Tautomerisierung zum dreifach koordinierten Phosporamidit-Zwischenprodukt, was eine oxidative Aminierungsreaktion fördert. Die Reaktionszeit der oxidativen Aminierung wurde in Eintrag 4 auf 1 Minute eingestellt und die NMR-Ausbeute wurde auf > 99 % erhöht; Daher wurden die Bedingungen in Eintrag 4 als optimal ausgewählt. Unter den optimierten Reaktionsbedingungen wurden Phosphordiamidat-2-mere mit anderen Nukleobasen synthetisiert (Einträge 5, 6 und 7). Alle 2-mere wurden mit NMR-Ausbeuten von > 99 % erhalten, was zeigt, dass die Reaktionen unabhängig von der spezifischen Nukleobase effizient abliefen. Obwohl Dimethylamin in H2O-Lösung als optimierte Bedingungen verwendet wurde, wurde keine Hydrolyse der H-Phosphonamidat-Bindung beobachtet. Dies wird auf die viel höhere Reaktivität von Dimethylamin als die von H2O gegenüber dem Chlorphosphoramidat-Zwischenprodukt zurückgeführt. Diese Ergebnisse stimmten gut mit den vorherigen Berichten überein29,30.

Das gewünschte Produkt und ein Triaminophosphinoxid-Derivat, bei dem es sich um den Rückstand von PyNTP handelte, wurden trotz unserer Versuche, das Phosphordiamidat-2-mer 4 zu isolieren, nicht durch Kieselgel-Säulenchromatographie getrennt. Daher wurden die Rohmischungen von 4 zur Synthese von 2-mer-Fragmenten verwendet ohne weitere Reinigung.

Wir analysierten die Synthese von zwei Arten von 2-mer-Fragmenten unter Verwendung einer Rohmischung aus Phosphordiamidat-2-meren 4, die durch eine optimierte Kondensation und oxidative Aminierungsreaktion als Eintopfreaktion erhalten wurde (Abb. 2). Zuerst haben wir versucht, ein 2-mer-Fragment mit der Aminogruppe 5cc aus einer Rohmischung von 4cc durch Behandlung mit 3-Cyanopyridin (CYP)-Trifluoressigsäure (TFA) in CH2Cl2-2,2,2-Trifluorethanol (TFE) (4) zu synthetisieren :1, v/v). Nach einer einfachen Extraktion und Reinigung durch Kieselgel-Säulenchromatographie erhielten wir die gereinigten 5 ml in einer isolierten Gesamtausbeute von 78 % (aus 1 c, 3 Schritte). Wir verwendeten das gleiche Verfahren zur Synthese von 5gt, das in einer isolierten Ausbeute von 96 % erhalten wurde (aus 1 g, 3 Schritte). Als nächstes versuchten wir, ein 2-mer-Fragment 7cc mit 5ʹ-H-Phosphonat aus der Rohmischung von 4cc zu synthetisieren, indem wir dem Verfahren in Abb. 2 folgten. Zuerst entfernten wir die 5ʹ-TBDPS-Gruppe von 4cc mit TBAF, gefolgt von einem einfachen Extraktion, um Verbindung 6cc zu erhalten. Die Verbindung 6cc wurde ohne weitere Reinigung für die nächste Phosphonylierungsreaktion eingesetzt. Als nächstes wurde die 5ʹ-O-Phosphonylierung von 6cc unter Verwendung von vorgemischtem PCl3 und Imidazol als Phosphonylierungsreagenz19 durchgeführt. Nach einer einfachen Extraktion und Reinigung durch Kieselgel-Säulenchromatographie erhielten wir das gereinigte 5ʹ-H-Phosphonat 2-mer 7cc in einer isolierten Gesamtausbeute von 91 % (aus 1c, 4 Schritte). 7ca wurde ebenfalls synthetisiert und mit dem gleichen Verfahren (aus 1c, 4 Schritte) in einer isolierten Ausbeute von 88 % erhalten. Diese beiden Arten von Fragmenten ließen sich leicht von einem Triaminophosphinoxid-Derivat trennen.

Synthese von 2-mer-Fragmenten.

Reagenzien und Bedingungen: (i) 3-Cyanopyridin (10 Äquiv.), CF3COOH (10 Äquiv.), CH2Cl2–CF3CH2OH (4:1, v/v), RT, 1 h; (ii) TBAF (1,5 Äquiv.), CH3COOH (1,5 Äquiv.), THF, 0 °C, 1,5 h; (iii) PCl3 (5 Äquiv.), Imidazol (17 Äquiv.), TEA (50 Äquiv.), CH2Cl2, − 78 °C, 30 Min.

Die erfolgreiche Synthese von 2-mer-Fragmenten führte zur Synthese eines Phosphodiamidat-4-mer unter Verwendung der 2-mer-Fragmente 5cc und 7cc durch eine Fragmentkondensationsreaktion. Wir kondensierten das H-Phosphonat 2-mer 7cc mit der Aminogruppe von 5cc unter Verwendung von PyNTP als Kondensationsreagenz für 20 Minuten, gefolgt von der oxidativen Aminierungsreaktion unter Verwendung von CCl4 und Dimethylamin, um Phosphordiamidat 4-mer 9cccc zu erzeugen (Abb. 3). Nach dem Entfernen aller flüchtigen Bestandteile unter vermindertem Druck wurde die resultierende Rohmischung mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) untersucht und die Kondensationsausbeuten anhand der Flächenverhältnisse des 4-mer 9cccc zum nicht umgesetzten 2-mer geschätzt 5cc. Die HPLC-Ausbeute betrug 97 %, was darauf hinweist, dass die Fragmentkondensation innerhalb von 20 Minuten nahezu quantitativ ablief. Dies war das erste Beispiel für die Synthese von PMOs mittels konvergenter Synthese. Allerdings lieferte BOMP mit HOBt als Abgangsgruppe ein niedrigeres Ergebnis (68 %) als PyNTP mit NT als Abgangsgruppe. Dies legt nahe, dass die Anwesenheit von NT als nukleophiler Katalysator für die Fragmentkondensationsreaktion wesentlich ist. Darüber hinaus waren die Retentionszeiten der RP-HPLC des Produkts 9cccc und der 2-mer-Fragmente (5cc und 7cc) deutlich unterschiedlich, was auf einen signifikanten Unterschied in der Lipophilie zwischen dem 4-mer- (9cccc) und dem 2-mer-Fragment (5cc und 7cc) hinweist ) (Siehe SI). Dieses Ergebnis zeigt, dass die konvergente Synthese die Reinigung des Produkts erleichtert.

Synthese von Phosphordiamidat 4-mer.

Nach dem gleichen Verfahren wurde ein Phosphordiamidat-4-mer 9gtca mit vier Arten von Nukleobasen (A, C, G und T) unter Verwendung von 2-mer-Fragmenten (5gt und 7ca) und PyNTP als Kondensationsreagenz hergestellt. Nach einer einfachen Extraktion wurden 4-mere (9cccc und 9gtca) ohne weitere Reinigung für die nächste Reaktion eingesetzt.

Anschließend untersuchten wir die Synthese von zwei Arten von 4-mer-Fragmenten (10 und 12) nach dem gleichen Verfahren wie bei der Synthese von 2-mer-Fragmenten (Abb. 4). Die 4-mer-Fragmente mit den Aminogruppen 10cccc und 10gtca wurden mit 66 % bzw. 71 % Ausbeute aus 5cc bzw. 5gt erhalten (3 Schritte). Darüber hinaus haben wir die 5ʹ-H-Phosphonat-4-mer-Fragmente von 12cccc und 12gtca in 72 % bzw. 76 % Ausbeute aus 5cc bzw. 5gt erhalten (4 Schritte). Bei diesen Reaktionen wurden keine nachweisbaren Nebenreaktionen auf die Nukleobasen beobachtet. Die Reinheit dieser Fragmente wurde durch NMR und HPLC bestätigt (siehe SI).

Synthese von 4-mer-Fragmenten.

Reagenzien und Bedingungen: (i): 3-Cyanopyridin (10 Äquiv.), CF3COOH (10 Äquiv.), CH2Cl2–CF3CH2OH (4:1, v/v), RT, 1 h; (ii) TBAF (1,5 Äquiv.), CH3COOH (1,5 Äquiv.), THF, 0 °C, 1,5 h; (iii) PCl3 (5 Äquiv.), Imidazol (17 Äquiv.), TEA oder N-Methylmorpholin (50 Äquiv.), CH2Cl2, − 78 °C, 30 Min.

Als nächstes synthetisierten wir 6-mer-PMO und 8-mer-PMO unter Verwendung von 2-mer-Fragmenten und 4-mer-Fragmenten (Tabelle 3). Alle Oligomere wurden durch Kondensation und oxidative Aminierungsverfahren synthetisiert. Nachdem wir alle flüchtigen Bestandteile unter reduziertem Druck entfernt hatten, analysierten wir die resultierende Rohmischung mittels RP-HPLC und schätzten die Kondensationsausbeuten durch Vergleich der Flächenverhältnisse der 6-mer- oder 8-mer-Fragmente mit den nicht umgesetzten 2-mer- oder 4-mer-Fragmenten, die an trugen Aminogruppe. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse. Zunächst synthetisierten wir ein 6-mer 15 über zwei verschiedene Syntheserouten (Route A und B), um den Effekt einer sterischen Hinderung durch die Länge der Fragmente zu untersuchen. In Route A kondensierten wir das 5′-H-Phosphonat-2-mer-Fragment 7cc mit der Aminogruppe des 4-mer-Fragments 10cccc, während wir in Route B das 5′-H-Phosphonat-4-mer-Fragment 12cccc mit der Aminogruppe kondensierten 2-mer-Fragment 5cc. In Route A verwendeten wir PyNTP als Kondensationsreagenz für die Kondensationsreaktion, um das gewünschte 6-mer 15 mit einer HPLC-Ausbeute von 95 % herzustellen (Eintrag 1). Bei Route B verlief die Kondensationsreaktion mit PyNTP als Kondensationsreagenz jedoch nicht ausreichend, was zu einer geringen HPLC-Ausbeute führte (26 %, Eintrag 2). Basierend auf diesen Ergebnissen beobachteten wir, dass längere 5ʹ-H-Phosphonatfragmente zu einer geringeren Kondensationseffizienz führten. Diese Daten zeigten, dass die sterische Hinderung der 5ʹ-H-Phosphonatfragmente entscheidend für die Kondensationseffizienz war. Allerdings war der Effekt der sterischen Hinderung von Fragmenten, die eine Aminogruppe trugen, im Vergleich zu 5ʹ-H-Phosphonatfragmenten weniger deutlich. Um die sterische Hinderung von 5ʹ-H-Phosphonatfragmenten zu überwinden, führten wir die Kondensationsreaktion von Route B unter Verwendung von MNTP durch, das eine höhere Aktivität als Kondensationsreagenz aufweist als PyNTP (Eintrag 3). Zu unserer Freude konnte die HPLC-Ausbeute auf 91 % gesteigert werden. Die Verwendung von MNTP verursachte Nebenreaktionen und war bei der Synthese von 2-mer unwirksam; Aufgrund seiner hohen Aktivität lieferte es jedoch das beste Ergebnis in der konvergenten Synthese. Als nächstes synthetisierten wir 8-mer 16 unter Verwendung von PyNTP und MNTP als Kondensationsreagenzien (Eintrag 4 bzw. 5; Route C). Wie erwartet ergab MNTP eine höhere Kondensationseffizienz (92 %, Eintrag 5). Schließlich synthetisierten wir ein weiteres 8-mer 17 mit allen vier Nukleobasen unter Verwendung von MNTP als Kondensationsreagenz (Route D), was ein 8-mer 17 mit einer HPLC-Ausbeute von 92 % ergab. Diese Ergebnisse zeigen, dass für die Fragmentkondensation die Auswahl der Kondensationsreagenzien entscheidend ist und dass MNTP das optimale Kondensationsreagenz für die konvergente Synthese von PMOs ist. Darüber hinaus zeigten HPLC-Ergebnisse einen signifikanten Unterschied in der Lipophilie zwischen den 8-mer- und 4-mer-Fragmenten (siehe SI).

Zusammenfassend untersuchten wir den Einfluss einer sterischen Hinderung, die durch die Länge der Fragmente verursacht wird, und zeigten, dass die sterische Hinderung der 5ʹ-H-Phosphonatfragmente für die Kondensationseffizienz entscheidend ist. Durch den Einsatz von MNTP als Kondensationsreagenz konnten wir dieses Problem lösen und 8-mer mit hervorragenden HPLC-Ausbeuten erhalten.

Schließlich versuchten wir, die Schutzgruppen der vollständig geschützten 8-mere 16 und 17 mit dem folgenden Verfahren zu entfernen: Detritylierung, Entfernung der TBDPS-Gruppe, Entschützung der Nukleobasen und Reinigung durch ODS-Säulenchromatographie (Abb. 5). Wir erhielten gereinigte 8-mere 18 und 19 mit 73 % bzw. 79 % Ausbeute aus 10cccc bzw. 10gtca (5 Schritte). Die Produktmengen reichten für die Charakterisierung durch ESI-MS, 1H-NMR und 31P-NMR aus.

Entschützung und Isolierung von 8-meren.

Reagenzien und Bedingungen: (i) 3-Cyanopyridin (40 Äquiv.), CF3COOH (40 Äquiv.), CH2Cl2–CF3CH2OH (4:1, v/v), RT, 1 h; (ii) TBAF (40 Äquiv.), THF, RT, 2 h; (iii) konzentriertes wässriges NH3-EtOH (3:1, v/v), 55 °C, 16 h; (iv) Umkehrphasen-Säulenchromatographie.

In dieser Studie haben wir eine neuartige Methode zur Lösungsphasensynthese von PMOs mithilfe eines H-Phosphonat-Ansatzes entwickelt. Wir haben die H-Phosphonat-Monomere direkt mit der Aminogruppe von Morpholino-Nukleosiden kondensiert, indem wir spezifische Kondensationsreagenzien vom Phosphonium-Typ verwendet haben, darunter PyNTP, BOMP und MNTP. Die resultierende H-Phosphonamidat-Verknüpfung wurde in einer Eintopfreaktion in ein stabiles N,N-Dimethylaminophosphordiamidat-Gegenstück umgewandelt. Diese Reaktionen verkürzten die Kupplungszeit erheblich und lieferten das Produkt quantitativ. Die erhaltenen Oligomere wurden für die nächste Kondensationsreaktion in Fragmente (5′-H-Phosphonatmonoester und 3′-NH-Derivate) umgewandelt und mit beträchtlichen Ausbeuten isoliert. Wir erreichten eine Fragmentkondensation mit bemerkenswerter Kondensationseffizienz, um mithilfe dieser Fragmente bis zu 8-mere zu synthetisieren. Dies ist der erste Bericht über die Lösungsphasensynthese von PMOs mithilfe einer Fragmentkondensationsreaktion. Die Fragmentkondensation verhinderte die Bildung des N-1-mers des Produkts und machte die Produktisolierung einfach. Da dieser Ansatz außerdem H-Phosphonamidat als Zwischenprodukt liefert, könnten durch eine geeignete Umwandlung des Zwischenprodukts verschiedene P-modifizierte PMOs wie TMOs erhalten werden28. Der Ansatz dieser Studie ist eine wirksame Alternative zur Synthese von PMOs. Die Synthese verschiedener P-modifizierter PMOs unter Verwendung des H-Phosphonamidat-Derivats sollte weiter untersucht werden.

Ein Morpholino-Nukleosid 1c (0,0284 g, 0,050 mmol) und ein H-Phosphonat-Monomer 2c (0,0473 g, 0,060 mmol) wurden durch wiederholte Coevaporation mit trockenem Pyridin getrocknet und in einer Mischung aus trockenem Pyridin (0,5 ml) und Acetonitril-d3 gelöst ( 0,5 ml). Der Lösung wurde bei 0 °C ein Kondensationsreagenz (0,15 mmol) zugesetzt und die Mischung 15 Minuten bei 0 °C gerührt. Die Lösung wurde in ein NMR-Probenröhrchen (5 mm × 180 mm) überführt und ein Spektrum aufgenommen. Die Bildung von 3cc wurde durch 31P-NMR-Spektren (δ 14,2, 13,3 ppm, 1JPH = 655, 661 Hz) bestätigt (Abb. S1–S6).

Ein Morpholino-Nukleosid (1a, 1g, 1c oder 1t, 0,050 mmol) und 5ʹ-H-Phosphonat (2a, 2g, 2c oder 2t, 0,060 mmol) wurden durch wiederholte Coevaporation mit trockenem Pyridin getrocknet und in einer Mischung aus trockenem gelöst Pyridin (0,5 ml) und Acetonitril-d3 (0,5 ml). Der Lösung wurde bei 0 °C ein Kondensationsreagenz (0,15 mmol) zugesetzt und die Mischung 20 Minuten bei 0 °C gerührt. Dem Reaktionsgemisch wurden bei 25 °C oder 0 °C ein Halogenierungsreagenz (I2, CBr4 oder CCl4) und Dimethylamin zugesetzt und das Gemisch wurde für die vorgesehene Zeit bei 25 °C oder 0 °C gerührt. Die Lösung wurde in ein NMR-Probenröhrchen (5 mm × 180 mm) überführt und ein Spektrum aufgenommen. Die Bildung von 4cc, 4aa, 4gg oder 4tt wurde durch 31P-NMR-Spektren bestätigt (4cc: δ 16,9, 16,5 ppm, 4aa: 16,8 ppm, 4gg: 16,9, 16,7 ppm und 4tt: 17,0, 16,8 ppm) (Abb. S7). –S21).

Für die Fragmentkondensation wurde das folgende Verfahren angewendet. 2-mer- oder 4-mer-Fragmente mit der 3ʹ-NH-Gruppe (5 μmol) und 2-mer- oder 4-mer-Fragmente mit einem H-Phosphonatmonoester an der 5ʹ-OH-Gruppe (7,5 μmol) wurden durch wiederholte Coevaporation mit trockenem Pyridin getrocknet und in einer Mischung aus trockenem Pyridin (50 μL) und Acetonitril (50 μL) gelöst. Der Lösung wurde bei 0 °C ein Kondensationsreagenz (30 μmol) zugesetzt und die Mischung 20 Minuten bei 0 °C gerührt. Zu der Mischung wurden CCl4 (10 μL, 100 μmol) und eine 9,5 M wässrige Dimethylaminlösung (20 μL, 190 μmol) bei 0 °C gegeben und die Mischung 1 Minute lang bei 0 °C gerührt. Dann wurde die Mischung mit CHCl3 (3 ml) verdünnt und mit CHCl3 (3 × 3 ml) und Toluol (2 × 3 ml) coevaporiert. Der Rückstand wurde mittels RP-HPLC analysiert. RP-HPLC wurde mit einem linearen Gradienten von 0–60 % MeCN für 60 Minuten in einem 0,1 M Triethylammoniumacetat-Puffer (pH 7,0) bei 50 °C mit einer Flussrate von 0,5 ml/min unter Verwendung einer C18-Säule (100 Å, 3,9 mm × 150 mm). Die Kondensationsausbeuten wurden anhand der Flächenverhältnisse des 4-mer-, 6-mer- oder 8-mer-Fragments zum nicht umgesetzten 2-mer- oder 4-mer-Fragment mit der 3ʹ-NH-Gruppe geschätzt.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind in den Hintergrundinformationen dieses Artikels verfügbar.

Kole, R., Krainer, AR & Altman, S. RNA-Therapeutika: Jenseits von RNA-Interferenz und Antisense-Oligonukleotiden. Nat. Rev. Drug Discov. 11, 125–140 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kilanowska, A. & Studzińska, S. In-vivo- und In-vitro-Studien zu Antisense-Oligonukleotiden – Eine Übersicht. RSC Adv. 10, 34501–34516 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Stephenson, ML & Zamecnik, PC Hemmung der viralen RNA-Translation des Rous-Sarkoms durch ein spezifisches Oligodesoxyribonukleotid. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 75, 285–288 (1978).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Summerton, J. Morpholino-Antisense-Oligomere: Argumente für einen RNase H-unabhängigen Strukturtyp. Biochim. Biophys. Acta 1489, 141–158 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Summerton, JE & Weller, DD US-Patent 5185444 (1993).

Summerton, J. & Weller, D. Morpholino-Antisense-Oligomere: Design, Herstellung und Eigenschaften. Nukleinsäure Ther. 7, 187–195 (1997).

CAS Google Scholar

Summerton, JE Morpholino, siRNA und S-DNA im Vergleich: Einfluss von Struktur und Wirkungsmechanismus auf Off-Target-Effekte und Sequenzspezifität. Curr. Spitze. Med. Chem. 7, 651–660 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sazani, P., Weller, DL & Shrewsbury, SB Sicherheitspharmakologie und Genotoxizitätsbewertung von AVI-4658. Int. J. Toxicol. 29, 143–156 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wu, B. et al. Dosisabhängige Wiederherstellung der Dystrophin-Expression im Herzmuskel dystrophischer Mäuse durch systemisch verabreichtes Morpholino. Gene Ther. 17, 132–140 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Heemskerk, H. et al. Präklinische PK- und PD-Studien zu 2′-O-Methylphosphorthioat-RNA-Antisense-Oligonukleotiden im mdx-Mausmodell. Mol. Dort. 18, 1210–1217 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Baker, DE Eteplirsen. Hosp. Pharm. 52, 302–305 (2017).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Heo, Y.-A. Golodirsen: Erste Genehmigung. Drugs 80, 329–333 (2020).

Artikel PubMed Google Scholar

Dhillon, S. Viltolarsen: Erste Genehmigung. Drogen 80, 1027–1031 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Shirley, M. Casimersen: Erste Genehmigung. Drogen 81, 875–879 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Langner, HK, Jastrzebska, K. & Caruthers, MH Synthese und Charakterisierung von Thiophosphoramidat-Morpholino-Oligonukleotiden und Chimären. Marmelade. Chem. Soc. 142, 16240–16253 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Harakawa, T., Tsunoda, H., Ohkubo, A., Seio, K. & Sekine, M. Entwicklung einer effizienten Methode zur Bildung von Phosphordiamidatbindungen unter Verwendung anorganischer Salze. Bioorg. Med. Chem. Lette. 22, 1445–1447 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Li, C. et al. Vollautomatische Fast-Flow-Synthese von Antisense-Phosphordiamidat-Morpholino-Oligomeren. Nat. Komm. 12, 4396 (2021).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kundu, J. et al. Synthese von Phosphordiamidat-Morpholino-Oligonukleotiden mithilfe der Trityl- und Fmoc-Chemie in einem automatisierten Oligo-Synthesizer. J. Org. Chem. 87, 9466–9478 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bhadra, J., Kundu, J., Ghosh, KC & Sinha, S. Synthese von Phosphordiamidat-Morpholino-Oligonukleotiden durch die H-Phosphonat-Methode. Tetraeder Lett. 56, 4565–4568 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Sobkowska, A. et al. Aryl-H-Phosphonate. 6. Synthesestudien zur Herstellung von Nukleosid-N-Alkyl-H-phosphonamidaten. J. Org. Chem. 62, 4791–4794 (1997).

Artikel CAS Google Scholar

Kraszewski, A., Sobkowskia, M. & Stawiński, J. Studien zu Reaktionen von Nukleosid-H-Phosphonaten mit bifunktionellen Reagenzien. Teil 1. Reaktion mit Aminoalkoholen. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1699–1704 (1993).

Artikel Google Scholar

Sobkowska, A., Sobkowski, M., Stawiski, J. & Kraszewski, A. Studien zu Aryl-H-phosphonaten. Synthese von Nukleosid-N-Alkylphosphonamidaten. Nucleoside Nucleotides Nucleic Acids 14, 703–706 (1995).

Artikel CAS Google Scholar

Kers, I., Stawiński, J. & Kraszewski, A. Aryl H-Phosphonate. 10. Synthese von Nukleosidphosphoramidat- und Nukleosidphosphoramidothioat-Analoga über H-Phosphonamidat-Zwischenprodukte. Tetrahedron 55, 11579–11588 (1999).

Artikel CAS Google Scholar

Tsurusaki, T., Sato, K. & Wada, T. Entwicklung einer neuen Synthesemethode für Oligodesoxynukleotide unter Verwendung von 3ʹ-H-Phosphonamidat-Derivaten. Org. Biomol. Chem. 21, 2486–2492 (2023).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhou, X. et al. Entwicklung einer konvergenten Flüssigphasensynthese von Oligonukleotiden im Kilogramm-Maßstab. J. Org. Chem. 87, 2087–2110 (2021).

Artikel PubMed Google Scholar

Wada, T., Sato, Y., Honda, F., Kawahara, S. & Sekine, M. Chemische Synthese von Oligodesoxyribonukleotiden unter Verwendung von N-ungeschützten H-Phosphonatmonomeren und Carbonium- und Phosphonium-Kondensationsreagenzien: O-selektive Phosphonylierung und Kondensation. Marmelade. Chem. Soc. 119, 12710–12721 (1997).

Artikel CAS Google Scholar

Oka, N., Shimizu, M., Saigo, K. & Wada, T. 1,3-Dimethyl-2-(3-nitro-1,2,4-triazol-1-yl)-2-pyrrolidin-1 -yl-1,3,2-diazaphospholidiniumhexafluorphosphat (MNTP): Ein starkes Kondensationsreagenz für Phosphat- und Phosphonatester. Tetrahedron 62, 3667–3673 (2006).

Artikel CAS Google Scholar

Stawinski, J. & Kraszewski, A. Wie man das Beste aus zwei Phosphorchemien herausholt. Studien zu H-Phosphonaten. Acc. Chem. Res. 35, 952–960 (2002).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Atherton, F., Openshaw, H. & Todd, A. 174. Studien zur Phosphorylierung. Teil II. Die Reaktion von Dialkylphosphiten mit Polyhalogenverbindungen in Gegenwart von Basen. Eine neue Methode zur Phosphorylierung von Aminen. J. Chem. Soc. 660–663. https://doi.org/10.1039/JR9450000660 (1945).

Atherton, F. & Todd, A. 129. Studien zur Phosphorylierung. Teil III. Weitere Beobachtungen zur Reaktion von Phosphiten mit Polyhalogenverbindungen in Gegenwart von Basen und deren Anwendung auf die Phosphorylierung von Alkoholen. J. Chem. Soc. 674–678. https://doi.org/10.1039/JR9470000674 (1947).

Referenzen herunterladen

Wir danken Frau Fukiko Hasegawa, Dr. Yayoi Yoshimura (Tokyo University of Science) und Takayoshi Torii (Ajinomoto Co.) für die Massenspektrummessungen. Wir möchten Enago (https://www.enago.jp) für die englischsprachige Rezension danken. Diese Arbeit wurde von JST, der Einrichtung von Universitätsstipendien zur Schaffung wissenschaftlich-technologischer Innovationen, Fördernummer JPMJFS2144 und AMED unter der Fördernummer JP21ae0121025 unterstützt.

Abteilung für Medizin und Biowissenschaften, Fakultät für Pharmazeutische Wissenschaften, Tokyo University of Science, 2641 Yamazaki, Noda, Chiba, 278-8510, Japan

Taiki Tsurusaki, Kazuki Sato, Hiroki Imai und Takeshi Wada

Forschungsinstitut für biowissenschaftliche Produkte und Feinchemikalien, Ajinomoto Co., Inc., 1-1, Suzuki-Cho, Kawasaki, Kanagawa, 210-8681, Japan

Kunihiro Hirai und Daisuke Takahashi

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

TW erstellte die Forschungspläne. TT führte die Experimente durch. Alle Autoren analysierten die Daten. TT hat das Manuskript geschrieben. KS und TW haben das Manuskript überarbeitet. Alle Autoren haben die endgültige Fassung des Manuskripts genehmigt.

Korrespondenz mit Takeshi Wada.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tsurusaki, T., Sato, K., Imai, H. et al. Konvergente Synthese von Phosphordiamidat-Morpholino-Oligonukleotiden (PMOs) durch den H-Phosphonat-Ansatz. Sci Rep 13, 12576 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38698-2

Zitat herunterladen

Eingegangen: 27. April 2023

Angenommen: 13. Juli 2023

Veröffentlicht: 03. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38698-2

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.